رنگ آمیزی گیمسا و کاربرد های آن

بدن ما از انواع مختلف سلول های خونی تشکیل شده است. این سلول ها که دارای اشکال و اندازه های مختلفی هستند، طبق ساختار خود رنگ آمیزی می شوند. بنابراین سلول ها را به ۳ دسته خنثی، اسیدوفیل و بازوفیل تقسیم می کنند. گروهی از سلول ها یا اجزای سلولی که خاصیت بازوفیلی دارند، تمایل زیادی به جذب رنگ های اسیدی و در مقابل گروهی از سلول ها که خاصیت اسیدوفیل دارند تمایل بیشتری به جذب رنگ های بازی دارند. به همین دلیل تمامی محلول های رنگ آمیزی مورد استفاده در آزمایشگاه ها ترکیبی از این سه نوع است.

یکی از پرکاربرد ترین محلول های رنگ آمیزی برای سلول های خونی ، رنگ های رومانوفسکی است. این دسته از رنگ ها دارای دو جزء اساسی بازی(متیلن بلو) و اسیدی(ائوزین یا آزور) است. رنگ های رومانوفسکی به ۴دسته زیر تقسیم می شوند:

۱.رنگ گیمسا

۲.رنگ لیشمن

۳.رنگ رایت

۴.رنگ Field’s

که در این مقاله به بررسی روش رنگ آمیزی گیمسا خواهیم پرداخت.

رنگ آمیزی گیمسا چیست؟

گیمسا به عنوان یکی از رایج‌ ترین و محبوب ترین رنگ آمیزی میکروسکوپی در دنیا شناخته می شود.  در واقع گیمسا مخلوط استاندار شده ای از رنگ های(آزور، ائوزین و متیلن بلو) است که اولین بار توسط شیمی دان آلمانی به نام گوستاو گیمسا ساخته شد. گاوستاو گیمسا از محلول بدست امده برای اولین بار در پروژه تحقیقاتی انگل ایجاد کننده مالاریا استفاده کرد. فرمول شیمیایی گیمسا C14H14ClN2S بوده و جرم مولکولی آن ۲۹۱.۸ گرم بر مول است.

رنگ گیمسا به دلیل ساختار منحصر به فرد خود در بسیاری از بخش های مختلف آزمایشگاهی(هماتولوژی،سیتولوژی، هیستولوژی،میکروبیولوژی و…) کاربرد داشته و به عنوان رنگ همه کاره از آن یاد می شود.

کاربرد رنگ آمیزی گیمسا

• رنگ آمیزی سلول های خونی(شمارش گلبول های سفید و تمایز بین سلول های مختلف خون)
• رنگ آمیزی کروموزوم و شناسایی انحرافات کروموزومی
• شناسایی مالاریا و یا سایر انگل های خونی
• رنگ آمیزی کپسول های کلبسیا، پنوموسیستیسر جیرووسی، هیستوپلاسما کپسولاتوم
• رنگ آمیزی نمونه های بافتی(لوزه، طحال، معده و مغز استخوان)

لوازم مورد نیاز جهت رنگ آمیزی گیمسا

۱.محلول گیمسا

۲.بافر با پی اچ ۷.۲(جهت رقیق سازی محلول های رنگ آمیزی)

۳.اسلاید شیشه ای

۴.آب مقطر

۵.پیپت پاستور

۶.کوپلین جار یا پتری دیش

۷.نمونه خون(خون تازه مویرگی یا جمع آوری شده از رگ که حاوی EDTA باشد)

لوازم مورد نیاز جهت تهیه محلول رنگ آمیزی گیمسا

۱.پودر گیمسا(۳.۸ گرم)

۲.متانول خالص(۲۵۰ میلی لیتر)

۳.گلیسرول(۲۵۰میلی لیتر)

۴.ترازو آزمایشگاهی

۵.قاشق اندازه گیری

۶.استوانه مدرج

۷.قیف شیشه ای یا پلاستیکی

۸.بطری شیشه ای درپیچ دار تیره(حجم ۵۰۰ میلی لیتر)

۹.کاغذ توزین

۱۰.مهره های شیشه ای تمیز شده با الکل(۳تا۵ میلی متر)

۱۱.شیکر
فروش رنگ آماده مصرف گیمسا

روش تهیه رنگ گیمسا در آزمایشگاه

• تعدادی از مهره های شیشه ای که توسط الکل تمیز شده را در بطری شیشه ای درپیج دار، تیره رنگ، خشک و عاری از هرگونه مواد شیمیایی بریزد.
• مقداری از پودر گیمسا(۳.۸گرم) را با استفاده از ترازو آزمایشگاهی وزن کرده و توسط قیف داخل بطری حاوی مهره های شیشه ای با دقت بریزید.
• ۱۰۰میلی لیتر متانول را توسط قیف به بطری اضافه کنید.
• درب بطری را بسته و به مدت ۲-۳ دقیقه به صورت دورانی بطری را تکان دهید تا پودر گیمسا به آرامی در متانول حل شود.
• ۲۵۰ میلی لیتر گلیسرول موجود را به محلول فوق(متانول و گیمسا) اضافه کرده و مجددا به مدت ۳-۵ دقیقه به خوبی مخلوط کنید.
• ۱۵۰میلی لیتر باقی مانده از متانول را به آرامی به مخلوط اضافه کرده به نحوی که تمامی قطرات گلیسرول موجود در قیف پاک شده و درون بطری در پیچ دار ریخته شود.
•  مخلوط حاصل را به مدت ۷روز(حداقل) روزی ۶ بار به مدت ۲-۳ دقیقه با استفاده از شیکر مخلوط کنید.
• در نهایت محلول رنگ گیمسا آماده بوده و با استفاده از لیبل تاریخ تولید، انقضا و شخص تهیه کننده را مشخص کنید.

رنگ گیمسا حاصل را در مکانی خنک و به دور از نور خورشید نگهداری کرده و درب بطری را جهت جلوگیری از جذب بخار آب هوا محکم کنید.

مراحل آماده سازی اسلاید نمونه

۱.یک قطره خون از توسط لوله مویین از لوله آزمایش برداشته و بر روی لام آزمایشگاهی تمیز قرار دهید.(درصورتی که از نمونه خون پاشنه ای یا انگشت استفاده می کنید، اولین قطره خون را دور بریزید)

۲.با استفاده از لام تمیز دیگری قطره خون ریخته شده را به آرامی پخش کنید(زاویه لامل ۳۰تا ۴۵ درجه نسبت ببه سطح لام باشد)

۳.اجازه دهید لام در معرض هوا کاملا خشک شود

۴.تمامی قسمت های نمونه روی لام را به متانول آغشته کرده و اجازه دهید کاملا خشک شود.(جهت فیکس یا تثبیت شدن نمونه)

۵.نمونه را به محلول گیمسا که به نسبت ۱:۲۰ رقیق شده به مدت ۲۰ دقیقه آغشته کنید(برای رقیق شدن محلول گیمسا از بافر فسفات استفاده کنید)

۶.پس از گذشت ۲۰ دقیقه لام را با مقدار آب مقطر شست و شو دهید.(از شست و شوی بیش از حد خودداری کنید زیرا باعث بی رنگ شدن لکه خونی می شود)

۷.لام را در معرض هوا قرار داده تا کاملا خشک شود.(از خشک کردن نمونه در دستگاه انکوباتور اجتناب کنید)

۸.نمونه را جهت بررسی میکروسکوپی بر روی میکروسکوپ قرار داده و با لنز ۴۰ یا ۱۰۰ می توانید اجزای سلولی نمونه را بررسی نمایید.

نتایج مشاهدات میکروسکوپی نمونه مورد بررسی

نکته

۱.درصورت تهیه گستره خونی ضخیم، هنگام رنگ آمیزی از محلول رقیق شده گیمسا به نسبت ۱:۵۰ استفاده کنید. برای این کار ۱ میلی لیتر محلول گیمسا را با ۴۹ میلی لیتر بافر فسفات ترکیب کرده و نمونه را به مدت ۳تا ۵ دقیقه به آن آغشته کنید.

۲.برای رنگ آمیزی دقیق تر، بهتر است گسترش های نازک و ضخیم نمونه در دو لام مجزا تهیه شود. درصورتی که در یک لام خونی دو نوع گسترش ضخیم و نازک وجود داشت، مراحل رنگ آمیزی آن مشابه گستره خونی ضخیم خواهد بود.

۳.برای بررسی میکروسکوپی نمونه، از مطالعه بر روی قسمت های ضخیم و یا بسیار نازک خودداری فرمایید. زیرا تراکم سلول ها در این مناطق مناسب نبوده و باعث ایجاد خطا در تشخیص می شود.